光學顯微鏡
2024-04-12(5460)次瀏覽
光學顯微鏡使用可見光進行照明，用光學透鏡進行聚焦，人眼或者 CCD/CMOS 相機進行觀察。基本的明場照明顯微鏡由光源，目鏡，物鏡，載物台，聚光鏡，光圈等部件組成。收到衍射效應的限製，光學顯微鏡的分辨率極限, 其中 NA 是數值孔徑(Numerical Aperture)，為物鏡與樣品間介質折射率以及孔徑角正弦值的乘積 ，是光學顯微鏡重要的參數之一。阿貝極限將光學顯微鏡的分辨率限製在約200納米處。 為了提高顯微鏡的成像素質，擴展應用範圍，光學顯微鏡經過不斷的發展改進，已經成為一個龐大的家族。
成像手段：普通寬場成像 (Wide field) ：光學顯微鏡基本的成像光路全內反射熒光(TIRF)：利用光在介質界麵發生全反射，在表麵形成倏逝波的特性，隻對樣品表麵 200nm 左右深度內進行成像，隔絕來自焦外光線的幹擾。共聚焦(Confocal)：利用空間針孔對焦外光線進行隔絕，對樣品進行逐點掃描成像，大大提高z軸分辨率。多光子(Multi-Photon)：利用長波長的光波繞射能力強，穿透能力高的特性，讓熒光分子同時吸收多個長波長光子激發短波長熒光，從而實現使用較低能量的光照來對厚樣品成像。目前成像的深度已經達到毫米級別。光片 (Light sheet)：對垂直於物鏡光軸的切片進行照明，避免了對焦外部分樣品的照明，大大提高z軸分辨率，同時相對 confocal 成像速度更高。結構光 (Structured light)：將照明光進行正弦調製或其它形式的調製形成結構光照明，與樣品表麵形成摩爾紋，使得一部分高頻信息能夠被觀察到。這種方法高能夠提升兩倍的分辨率，屬於一種超分辨技術。受激發射損耗 (Stimulated Emission Depletion, STED)：熒光顯微鏡中，激發光由於衍射效應，在樣品上形成的是一個亮斑，亮斑內的熒光分子均被激發產生熒光，STED在激發光上嵌套一個環形光，使對應環形區域的分子發生受激輻射而不產生熒光，隻有中心區域分子產生熒光，從而突破衍射極限限製的分辨率。STED的分辨率可以達到30nm左右。隨機光學重構 (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM)：隨機激發單個熒光分子，對其光斑進行擬合得到中心分子的位置，不斷隨機激發分子並將得到的圖案疊加，得到超越衍射極限分辨率的圖像。STORM的分辨率可以達到20nm左右。
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